лікування генетичних хвороб

Статті Соросівського Освітнього журналу в текстовому форматі ЛІКУВАННЯ ГЕНАМИ - ФАНТАСТИКА ЧИ РЕАЛЬНІСТЬ? (Фаворова О. О., 1997), БІОЛОГІЯВ статті описаний принципово новий підхід до лікування спадкових, онкологічних та інфекційних захворювань - генна терапія. В клітини хворого вводиться додатковий функціонуючий ген, який іліісправляет вроджену помилку обміну речовин, або надає організму нові властивості, завдяки яким відбувається одужання пацієнта. ЛІКУВАННЯ ГЕНАМИ - ФАНТАСТІКАІЛІ РЕАЛЬНІСТЬ? О. О. ФАВОРОВАРоссійскій державний медичний університет ЗАМІСТЬ ВВЕДЕНІЯСегодня кожному старшокласнику відомо, що генетична інформація, закодована в послідовності основ ДНК, спрямовує і контролює синтез РНК і білків. Тому ген ЧС - сукупність молекул ДНК у кожній окремій клітці - являє собою "книгу доль" організму, в якій записано, як це жива істота, будь то людина, тварина, рослина, мікроб або вірус, виглядає, живе і передає свої властивості наступному поколінню . У багатоклітинних організмів ця геномна книга розбита на глави - хромосоми, а сторінкам відповідають окремі гени - основні одиниці спадковості, кожна з яких несе генетичну інформацію для певного білка або РНК. На жаль, в цю книгу, як і в набрану друкарським способом, закрадаються помилки: може бути пропущена, вставлена ??або замінена на іншу окрема літера (нуклеотідний залишок ДНК), а іноді відбувається вставка або втрата великого фрагмента тексту - декількох сторінок або глави. Такі зміни генетичного матеріалу називаються мутаціями, і якщо мутації спотворюють інформацію, записану в генах, або зачіпають регуляторні області, приводячи до вимикання генів, то вони є причиною генетичних захворювань. Якщо подібні мутації відбуваються в клітинах зародкового шляху організмів, що розмножуються статевим шляхом, то вони передаються у спадок і захворювання стає спадковим. У світі кожна сота дитина народжується з серйозним спадковим дефектом, і кількість таких дефектів невблаганно зростає. Спадкові відхилення, як правило, призводять до фізичних або розумових порушень і передчасної смерті. Для більшості з відомих у даний час більш ніж 4000 спадкових захворювань не знайдено досить ефективних способів лікування. Порятунком від спадкових захворювань могло б стати введення в організм хворого непошкодженою копії мутантного ділянки ДНК. Ідея, ще недавно здавалася фантастичною, стає цілком реальною завдяки досягненням в галузі генетичної інженерії. Ця технологія дозволяє виділяти індивідуальні гени і послідовності ДНК (клонувати ДНК), а потім цілеспрямовано змінювати їх в пробірці, створюючи рекомбинантную ДНК - нові поєднання послідовностей нуклеотидів. Молекули рекомбінантної ДНК, що містять неушкоджену копію мутантного ділянки ДНК і сконструйовані таким чином, щоб їх можна було ввести в клітини нового господаря, зможуть замінити пошкоджений ген, направляючи синтез відсутнього продукту, або ж змусять працювати наявний у господаря, але вимкнений ген. Відбудеться зміна генетичного матеріалу організму, або його генотипу, і як наслідок - виправлення вродженої помилки обміну речовин. Спадкове захворювання буде вилікувано за допомогою генотерапії. Ще одним важливим напрямком генотерапіі може стати спрямоване привнесення властивостей, які раніше не властивих даному типу кліток. Передбачається, що, вводячи в організм нові, не властиві йому гени, можна буде лікувати онкологічні, інфекційні та аутоімунні захворювання. МЕТОДИ ПЕРЕНЕСЕННЯ "ЛІКУВАЛЬНИХ" ГЕНОВМетод генотерапіі знаходиться поки на ранній стадії розвитку, хоча виконана значна частина роботи по створенню способів перенесення генів лабораторним тваринам. Тварини, що несуть чужорідний ген, отримали назву трансгенних. Перші трансгенні миші - основний об'єкт для подальших досліджень - були отримані в 1981-1982 роках, а вже в 1985 році обрані вченими гени були перенесені сільськогосподарським тваринам (кроликам, свиням і вівцям) з метою поліпшення корисних для людини властивостей. Паралельно аналогічні успіхи були досягнуті з рослинами. Перша успішна спроба застосувати генотерапію в клінічній практиці була зроблена в 1990 році в США. Дитині, яка страждає на рідкісне захворювання - важким комбінованим імунодефіцитом, - яке пов'язане з дефектом гена, що кодує фермент аденозіндезамінази, була введена неушкоджена копія гена. І хоча використаний метод передбачав багаторазове введення гена протягом усього життя пацієнта, тобто, строго кажучи, не забезпечував повного лікування, була відкрита нова ера в медицині. Існують декілька підходів до лікування генами. Гени можна вводити в статеві клітини (сперматозоїди чи яйцеклітини), в клітини ембріона на ранніх стадіях розвитку або в соматичні клітини (клітини тіла, крім полових або їх попередників). Введення генів у статеві клітини означає, що придбане властивість буде передаватися з покоління в покоління. Саме цей метод широко використовується при отриманні трансгенних тварин, але він навряд чи застосовний до людей з етичних міркувань. Дійсно, чи маємо ми право втручатися в еволюцію людини? Чи виправданий ризик внесення в генофонд змін, адже ми ще не знаємо всієї складної системи взаємодії генів і їх регуляції і, замінюючи один "хворий" ген, можемо порушити роботу інших і тим самим замість очікуваної користі принести шкоду, а може бути, і загибель людині як виду. Генотерапія соматичних клітин на відміну від статевих зачіпає організм тільки самого пацієнта і тому розробляється в якості основного підходу. При цьому велике значення має правильний вибір типу соматичних клітин, які повинні забезпечити тривале збереження і функціонування внесеного "лікувального" гена. Спадкові захворювання можуть бути обумовлені дефектом одного або декількох генів, а також великими генетичними змінами, наприклад втратою цілої хромосоми. Безумовно, на сучасному етапі можна намагатися лікувати генами тільки захворювання першого типу, так звані моногенні, за умови, якщо відповідальний за дефект ген вже виявлений і клонований, тобто отриманий матеріал для введення хворому. В принципі існують два шляхи передачі хворому "лікувального" гена. Якщо хвороба пов'язана з відсутністю або малими кількостями білкового продукту дефектного гена, то достатньо ввести в клітину неушкоджений ген і дати йому можливість працювати; в результаті з'являться достатні кількості білка-продукту. Таким чином, внесена копія гена заместит за функціями зберігається в геномі хворого дефектний ген, тому цей підхід отримав назву замісної терапії. Всі використовувані в даний час клінічні методи переносу генів засновані на внесенні в клітку додаткових кількостей ДНК, тобто на замісної терапії. Іншим, ідеальним способом виліковувати генетичні захворювання могла б бути коригуюча (або що виправляє) терапія, за допомогою якої дефектний ген реально замінювався б в геномі нормальної копією. Цього можна досягти грунтуючись на здатності двох молекул ДНК до рекомбінації - обміну за допомогою спеціальних ферментів фрагментами полінуклеотидних ланцюгів. Однак через вкрай низьку ефективність цього методу в умовах лабораторії до практичного використання корегуючої терапії поки дуже далеко. До цих пір ми не обговорювали, яким шляхом "лікувальний" ген може бути введений в клітини хворого. Генетична модифікація соматичних клітин може проводитися або безпосередньо в організмі хворого, або шляхом введення функціонального гена в попередньо виділені і культивовані клітини пацієнта, які потім повертають назад в організм. Обидва способи мають недоліки та обмеження, але в цілому другий спосіб використовується в даний час найчастіше через свою більшої ефективності. У табл. 1 перераховані розроблені методи введення ДНК в тварини клітини і вказана їх застосовність для доставки генів у культуру клітин або безпосередньо до органу. Хімічний метод доставки полягає в тому, що якщо до очищеної ДНК додати іони Ca2 + або деякі інші позитивно заряджені з'єднання, то утворюється осад поглинається культивованими клітинами. При цьому лише дуже невелика частина внесеної ДНК проникає в ядра клітин, тобто ефективність переносу генів вкрай низька. Метод електропорації (створення мікроскопічних пір в мембранах клітин за допомогою електричного високовольтного розряду) кілька більш ефективний, проте при цьому можливі серйозні пошкодження клітин. Обидва описаних методу, так само як мікроін'єкція ДНК в окрему клітку за допомогою тонких скляних піпеток, не застосовуються для генотерапії. На відміну від мікроін'єкції звичайна ін'єкція розчину ДНК шприцом і голкою може використовуватися для перенесення генів в деякі тканини організму (наприклад, в м'язи). В останні роки запропоновані нові способи доставки ДНК в соматичні клітини, які можна застосовувати для лікування генами. З фізичних методів слід назвати бомбардування частинками, коли ДНК наноситься на мікроскопічні металеві "дробинки" і вистрілюється в клітку. Внесення ДНК в комплексі з ліпосомами - штучними мембранними бульбашками, приготованими з ліпідів, які зливаються з плазматичною мембраною клітини, - забезпечує досить ефективний перенос в неї ДНК. Пропонується також використовувати комплекси ДНК з білками, для яких на поверхні клітини є специфічні рецептори. Після зв'язування рецептором білка чужорідна ДНК разом з білком буде поглинена клітиною-мішенню. Нарешті, ще один підхід використовує природну здатність вірусів проникати в клітини і привносити в них власний генетичний матеріал. Останнім часом на основі генетичного матеріалу вірусів створено безліч генноїнженерних конструкцій, службовців векторами, тобто засобами доставки нових генів у клітини. Використовують ретровірусних (їх особливості будуть пояснені пізніше) і аденовірусні вектори, а також вектори на основі деяких інших вірусів. Головне в методі перенесення генів - включається (інтегрує) Чи новий ген в хромосому клітини-мішені. Для активно діляться клітин відсутність інтеграції внесеного гена в клітинну ДНК означає його неминучу втрату в клітинах-нащадках (рис. 1). Однією з основних причин того, що в 80% випадків для внесення чужорідної ДНК при клінічних випробуваннях на людях використовували ретровірусних вектори, є його стабільна інтеграція в клітинний геном. Крім того, ці вектори забезпечують високу ефективність доставки генів і не призводять до відчутних пошкоджень в клітці-мішені. На відміну від ретровірусних аденовірусні вектори в геном інтегруються. Далі ми докладніше зупинимося на будові ретровірусів і векторів на їх основі. На початку статті ми говорили про те, що генетична інформація записана в клітці у формі ДНК. На матриці ДНК синтезуються різні типи молекул РНК, один з яких (інформаційна, або матрична, РНК) спрямовує синтез білків. Це фундаментальне положення, сформульоване на зорі молекулярної біології, отримало назву основний догми молекулярної біології (рис. 2). У своїй первісній формі основна догма свідчила, що в природі можливі синтез РНК на ДНК і синтез білка під контролем РНК, але ні в якому разі не в зворотному напрямку. Однак в 1970 році було встановлено, що онкогенні, тобто викликають рак, РНК-віруси тварин (а всі віруси можна розділити на дві великі групи залежно від того, яку нуклеїнову кислоту - ДНК або РНК - вони містять в якості генетичного матеріалу) здатні синтезувати ДНК на своїй РНК як на матриці. Цей процес одержав назву "зворотної транскрипції" на відміну від прямої транскрипції ДНК РНК, а здійснюють його віруси, які принципово відрізняються від інших живих організмів за типом перетворення генома, стали називати ретровирусами (від лат. Retro - назад, назад). На рис. 3 схематично представлені будова частинок ретровируса (зліва вгорі) і його життєвий цикл. Серцевина вірусу, побудована із спеціальних вірусних білків, містить дві ідентичні молекули одноцепочечной РНК, а також нечисленні молекули вірусних ферментів. Серцевина оточена оболонкою, зібраної з клітинних мембран господаря з вкрапленнями ще одного вірусного білка. Останній забезпечує прикріплення вірусу до клітини. Слідом за цим відбуваються "роздягання" РНК і її проникнення разом з білками серцевини вірусу в клітину, де спеціальний вірусний фермент каталізує зворотну транскрипцію РНК в ДНК. Дволанцюжкова вірусна ДНК переміщається в клітинне ядро ??і вбудовується в хромосому. Ця властивість ретровируса забезпечує стабільне збереження його генетичної інформації: репліціруясь разом з клітинної ДНК при поділі клітини, вірусспеціфіческой ДНК (провірус) передається в дочірні клітини. Провірус направляє синтез вірусних білків і РНК, які потім збираються в частинки і виходять з клітини, отпочковиваясь від клітинної мембрани. Ще одним унікальним властивістю ретровірусів є те, що в складі їх генома можуть бути присутніми послідовності нуклеотидів, які відрізняються від власних генів вірусу і, як виявилося, захоплені з ДНК клітини-хазяїна. Таким чином, для ретровірусів характерна передача генетичної інформації в напрямку РНК ДНК РНК, і вони є природними генетичними векторами. Тепер ясно, чому на їх основі зручно створювати штучні вектори для перенесення генів. Дійсно, якщо позбавити ретровірус генетичного матеріалу, що кодує вірусні білки, то це призведе, як показано на рис. 3, до неможливості давати потомство нових вірусних частинок. На звільнене в геномі вірусу місце можна ввести чужорідний ген і таким чином створити ретровірусний вектор. А ось розмножуватися такий дефектний вірус зможе тільки в присутності іншого вірусу-помічника з незміненою РНК, чиї білки будуть "приватизовані" нашим вектором. Саме так на основі вірусу лейкозу мишей сконструйовані вектори, які забезпечують високоефективний перенесення генів і їх стабільне вбудовування в хромосому клітин-мішеней. А якщо вже вектор вбудувався в клітинну ДНК, то він буде передаватися при нормальному розподілі всьому потомству цієї клітини. Ця властивість надзвичайно важливо для стійкого виправлення генетичного дефекту. Незважаючи на очевидні достоїнства ретровірусних векторів, їх можливості далеко не безмежні. Так, ретровірусна ДНК може вбудовуватися в хромосомну ДНК тільки тих клітин, які здатні до активного поділу. Іншим серйозним недоліком ретровірусних векторів є те, що вони вбудовуються в геном клітин господаря безладно, тобто в кожній клітині включення відбувається в різні ділянки будь-який з хромосом. Це створює проблеми, з яких відзначимо одну - теоретичну можливість злоякісного переродження окремих клітин господаря через пошкодження їх генетичного матеріалу при вбудовуванні вектора. Проте, як уже зазначалося, гідності ретровірусних векторів роблять їх основною системою доставки генів при клінічних випробуваннях. ОБЛАСТІ ЗАСТОСУВАННЯ Генотерапія табл. 2 перераховані спадкові захворювання, які намагаються лікувати методом генотерапії. При згаданому вище комбінованому імунодефіциті, пов'язаному з дефектом аденозіндезамінази, перенесення "лікувального" гена виробляли в Т-лімфоцити крові (1990 рік, США) або в стовбурові клітини кісткового мозку (1992 рік, Італія; 1993 рік, Великобританія-Франція). Витягнуті у хворого клітини культивували в пробірці, за допомогою ретровирусного вектора вводили неушкоджений ген аденозіндезамінази, дефект якого викликав захворювання, і повертали клітини хворим. З дефектом цього ферменту пов'язано 25% випадків всіх відомих вроджених порушень імунних механізмів (імунодефіцитів). Імунодефіцити, пов'язані з дефектом інших ферментів, також, ймовірно, можна буде лікувати вводячи функціонально активні копії відповідних генів. Ще одна група спадкових захворювань, для якої можна розраховувати на успішне лікування генами, введеними в стовбурові клітини кісткового мозку, - це так звані лізосомні хвороби накопичення, на частку яких припадає близько 10% випадків всіх генетичних дефектів. Відомо, що лизосома - органела еукаріотичної клітини - містить 40 ферментів, відповідальних за внутрішньоклітинний розщеплення різних макромолекул. Мутація гена, що кодує той чи інший лізосомними фермент, призводить до того, що нерозщеплений субстрат цього ферменту накопичується в лізосомах, що й обумовлює патологію.